细菌源蛋白质农药作用机制与应用

摘要：细菌源蛋白质农药作为生防制剂,在植物病害防治上具有重要的作用。研制细菌源蛋白质农药以控制农作物病害是植物保护的新思路、新途径。文中介绍了细菌源蛋白质生物农药的研究进展、发展优势、种类、作用机制以及应用现状。同时,对细菌源蛋白质农药防治植物病害存在的问题及未来发展前景进行了展望。

　　关键词：细菌; 生物农药; 作用机制; 应用现状; 发展前景;

　　目前，我国拥有近2100家农药企业，国内生产农药量近180万t，农药出口量已近48万t，已成为亚洲第一农药生产大国。农业作为整个食品生产的源头，也是食品污染源的首个环节，同时也是最薄弱的环节，农产品的质量关系到食品安全，化学农药的大量生产，已对我国的生态环境造成了严重的污染，并影响着食品安全，由于食品安全问题所导致的疾病即食源性疾病，已成为对人类身体健康危害最大的一类疾病，严重威胁消费者的身体健康[1,2]。传统化学农药高效、剧毒、高污染的性质是导致污染的主要因素，因此人们想方设法寻求化学农药的替代品。细菌源蛋白质农药是由微生物产生的，对多种农作物具有生物活性的蛋白激发子类药物。通过激发植物自身的抗病防虫、生长发育相关基因的表达，增强植物的免疫能力，促进植物生长。它是一种新型、广谱、高效、多功能生物农药。近年来，随着新型环保生物技术的不断研究与发展，有关激发植物免疫抗病和促进作物增产作用的细菌源蛋白质农药的研究，已受到国内外的广泛关注和重视[3]，本文对细菌源蛋白质农药研究现状与展望进行综述，为新型细菌源蛋白质农药作为植物生防制剂提供参考。

　　1 我国生物农药的发展背景

　　生物农药是指利用生物活体或其代谢产物，针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂。生物农药按来源可分为植物源农药、动物源农药、微生物源农药，按有效成分可分为生物碱、昆虫抗菌蛋白、苏云金芽孢杆菌、有毒蛋白质[4]。生物农药是21世纪农药行业的新兴产业，其发展趋势代表着农药的发展方向，其合理使用是绿色食品生产中的重要保证措施。

　　微生物农药在生物农药中所占的比例最大，尤其是细菌源农药占生物农药的55%。蛋白质农药是新兴起的生物农药，其中细菌源蛋白质生物农药是对农作物具有很强的生物活性的一类蛋白质药物，属于新型微生物蛋白质农药，也是国内外研究中较早、成果较多、产量较大、施用较广的生物农药[5]。最早成功应用细菌作为生防因子的是放射形土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter K84）防治根癌土壤杆菌（A.tumefaciens）引起的桃、樱桃、葡萄、玫瑰等植物的根癌病，并取得了良好防效[6]。目前已开发为生物农药的生防细菌主要有假单孢杆菌属（Pseudomonas spp．）、芽孢杆菌属（Bacillus spp．）、土壤杆菌属（Agrobacterium spp．）、产碱菌属（Alcaligenes spp．）和链霉菌属（Streptomyces spp．）等[7]。

　　我国植物病害生物防治的研究和应用起步于20世纪50年代初，随着我国分子生物学技术、蛋白质工程、发酵工程、酶工程等高新技术的飞速发展，有关细菌源生物农药的菌株选育、发酵工艺优化、产品剂型加工和不同农作物上的应用技术等方面均取得较好的成果，尤其是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）。目前，Bt是全世界生物农药的主导产品之一，它不仅能杀灭100多种有害昆虫，而且不会对农作物和自然环境造成负面影响[8,9,10]。Bt的研究与开发应用规模上已处于世界领先水平[11]。中国农科院植保所邱德文研究员带领的科研团队，经几十年研制出世界上首个蛋白质生物农药阿泰灵，并获得国家专利创制产品。阿泰灵是植物免疫诱抗剂类蛋白质生物农药，其作用方式独特，无交互抗性，可防虫防病，绿色安全的同时可提高农作物产量[12]。

　　国外在20世纪70年代后开始重视生物农药的研发，后期发展迅猛。拮抗细菌及其代谢产物的开发利用，以及通过基因工程改造产生新型、高效、稳定、适生性强的拮抗细菌已成为生物农药发展的主要趋势[13]。

　　1.1 细菌源蛋白质农药的发展优势

　　细菌作为生防因子在植物病害防治上具有重要作用，细菌源蛋白质农药的优越特性（节能、环保、保护资源）比以往任何时期都更加受到世界各国政府的重视，成为世界各国生物技术研究机构和公司的研究热点[14]。

　　细菌作为生防因子具有非常大的优势，首先细菌拥有庞大的种群、具有较高的繁殖力、大多数细菌易于人工培养。其次细菌对病原菌的作用方式较广，可以通过竞争、拮抗和寄生、诱导植物产生抗性等方式对病原菌产生影响，细菌可从植物根际和叶部分离得到，接种后易于在植物上定殖，生防效果持久并且稳定，细菌易产生大量的次生代谢产物，具有固氮作用、合成铁载体、促进植物根系对无机离子的吸收、促进植物根际或叶围污染物质的降解，相关研究表明细菌作为生防制剂不但可以减少植物病害，而且有益于提高作物的产量[15]。

　　1.2 细菌源蛋白质农药的种类

　　在自然发生的生物防治和人类应用生物防治的活动中，拮抗细菌及其代谢产物都起到了重要的作用。目前，应用较多的拮抗细菌主要有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、放射形土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter）、洋葱球茎病假单胞菌（Burkholderiacepacia wisconsin）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、假单胞菌（Pseudo monascepacia）。其中枯草芽孢杆菌、放射形土壤杆菌、洋葱球茎病假单胞菌对防治土传性秧苗病害和水果及蔬菜病原菌效果非常显着[13]。芽孢杆菌是土壤和植物微生态区系的优势生物种群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用，同时芽孢杆菌也是目前生防细菌中研究较多的一类。芽孢杆菌的抑菌范围也很广，包括根部病害、枝干病害、叶和花部病害及收获后果品病害[16]。已报道的生防芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、蜡状芽孢杆菌（B.cereus）、多粘芽孢杆菌（B.polymyxa）、巨大芽孢杆菌（B.megaterium）、短小芽孢杆菌（B.pumilus)[17]。枯草芽孢杆菌抑菌谱广，同时又是多种植物蛋白质农药；既是微生物产生，又是自然界中的生物体或由生物所产生的，对多种农作物具有生物活性的蛋白激发子类药物。通过激发植物自身的抗病防虫、生长发育相关基因的表达，增强植物的免疫能力，促进植物生长。

　　2 细菌源蛋白质农药作用机制

　　细菌源蛋白质农药的作用机理在性质上类似动物免疫的抗病机制，属于一种新型、广谱、高效、多功能型的生物农药[18]。目前研究认为，细菌源蛋白质农药防治病害主要是通过对营养和位点的竞争、产生抗生素的拮抗以及诱导植物抗性等方面来达到生防效果。对于某一种生防细菌来说，其发挥生防作用的途径可能不仅仅是1种，而是多种生防机制共同作用的结果。如PGPR只与根有密切关系并定殖于根系，可以通过其他方式促进植物生长，如固氮作用、促进营养物质（如磷）的溶解、促进植物生长根际细菌[19]。

　　2.1 营养和位点的竞争作用

　　营养和位点的竞争是指存在于同一微小生物环境中的2种或2种以上微生物之间争夺这一环境内的空间、营养、氧气等现象。近年来，在生防细菌对植物营养和位点的竞争作用研究发现，亲缘关系相近的内生细菌与病原细菌对环境的需要比较相近，所以竞争较易发生。Shoda[20]研究表明，某些菌株通过产生一种嗜铁素（Siderophores）与环境中的铁离子高度结合，使植物病原菌缺乏铁营养而不能生长繁殖，从而占据一定的生态位。也有研究认为，内生细菌01-144对番茄青枯菌具有一定的拮抗作用，其抑菌机理是能够在番茄的根茎内较稳定的定殖，并能有效的与青枯病菌竞争生态位点[21]。

　　2.2 抗生素拮抗的作用

　　定殖生长于植物组织中的内生细菌，有些能够产生抗菌活性物质，这些抗菌活性物质主要有两类，一类是小分子量的抗生素类物质，另一类是大分子量的抗菌蛋白或细胞壁降解酶类[22]。内生细菌产生的抗生素物质包括双乙酰藤黄酚（PHL）、吩嗪羧酸（PCA）、藤黄绿脓素（PLT）、吡咯菌素（PRN）、HCN和一类丁酰内酯（Butyrolactones）。假单胞菌属在人工培养的条件下产生抗生素的能力最强，相关研究也最多，其产生的一类鼠李糖脂生物表面活性剂（Rhamnolipid biosur-factants）物质，能破坏腐霉菌卵孢子的原生质膜。有研究认为，BSS2208菌株因具有较强的拮抗作用、耐不良环境、繁殖速度快等特点而具有较强的竞争能力[23]。Yang等发现生防细菌荧光假单胞菌HC1-07通过产生氯霉素抑制病原菌，对小麦根部病害有较好的防治效果[24,25,26]。

　　2.3 诱导免疫作用

　　诱导免疫作用是植物被某种特定的环境因子刺激后形成的一种提高植物防卫能力的生理状态，能够抑制病原菌和寄生物。生防细菌诱导植物系统抗性的方式主要包括两个方面，一方面通过生防细菌的群体感应（quorumsensing,QS）信号分子AHL，以细胞密度依赖方式调控生防细菌与寄主植物间的互作，从而诱导植物依赖SA或ET途径的防卫反应[27]；另一方面以生防细菌产生的挥发性活性物或次级代谢产物为激发子介导植物产生各种防卫反应[28]。有研究表明hrp基因（Hypersensitive reaction and pathogenicity gene）可编码一大类能够诱导植物产生抗病反应的物质———过敏素类蛋白（Harpins），能诱导或激发植物产生免疫抗性。革兰氏阴性植物病原细菌激发非寄主植物产生过敏反应（HR），是hrp基因簇中特定的基因编码的一类蛋白类非特异性激发子[29]。1992年WEI等[30]首次从梨火疫欧文氏病菌（Erwinia amylovora)Ea321hrp基因簇中分离到由hrpN基因编码的蛋白类激发子HarpinEa。随后，各国的生物科学工作者又先后从丁香假单胞菌（Pseadomonas syringae）和青枯假单胞菌（Pseudomonas solanacearum）中分离到类似的富含甘氨酸、对蛋白酶敏感、热稳定的亲水性的Harpin类蛋白主要有Erwinia amylovora HrpN(HarpinEa）、HarpinW、E.rcarotovora amylovora subsp carotovora的HrpNEcc、E.chrysanthemi的HrpNEch、Pseudomona syringae pv glycinea的Harpinpsg、P.syringae pv phesiolicola的HrpNpsh、P.syringae pv syringae的Harpinpss、Ralstonia solanacearum的PopA1、Xoo的Harpinxoo、Xag的HpaG[31]。这些蛋白均能诱导植物产生过敏性坏死反应，与植物的抗病性有关。如革兰氏阴性细菌梨火疫病菌（Erwinia amylovora）和假单胞菌（Pseudo monascepacia）分泌的44kD蛋白Harpins[32]。卵菌纲的疫霉属（Phytophthora）和腐酶属（Pythium）分泌的10kD蛋白elicitins[33]诱导子或激发子对植物所产生的抗病信号经内源信号传导物质水杨酸（SA）、茉莉酸（jasmonicacid,JA）、乙烯（ethylene,Et）和一氧化氮（NO）而传导到整个植株。经过一系列抗病相关基因的调控和表达引起寄主防御酶系如苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine amm on ia lyase,PAL）、β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase）、几丁质酶（chitinase）、过氧化物酶（peroxidase,POX）等抗病物质如木质素与植保素等的变化，以及病程相关蛋白（pathogenesis related proteins,PRP）的调控与表达，来抵抗病原菌的侵入和发展，减轻和防止病害的发生。

　　3 细菌源蛋白质农药的应用

　　近年来，国内外专家学者对细菌源蛋白质农药的应用做了大量的研究，赵梅勤等[34]研究认为，水稻条斑病细菌的hpal基因产物可在非寄主烟草上激发HR反应，而将harpinXooc研制成含量为1%的蛋白微颗粒试剂用于水稻生育时期，可防治水稻稻瘟病、纹枯病及稻曲病，其蛋白激发了水稻产生诱导抗病性，使水稻产量得到提高。将harpinXooc研制成生物农药对植物防御病害具有十分重要的意义。王洪梅报道在芽孢杆菌中，枯草芽孢杆菌对青枯菌的抑菌能力最强，用枯草芽孢杆菌处理番茄种子能够有效地控制番茄青枯病，枯草芽孢杆菌不仅是良好的促生剂，还是有效的抗性诱导剂，它能减少80%的青枯病发病率[35]。蒋琳等[5]研究认为，昆虫体内具有抗菌蛋白，对植物病原菌具有极强的抗菌活性，可直接作用于细菌细胞膜，使其难以产生耐药菌，如家蚕鳞翅目B对十字花科蔬菜黑腐菌、水稻白叶枯病菌等。陈国参等[36]利用基因工程技术，对Harpin蛋白农药的工程菌株的发酵技术研究和规模发酵试验，试验结果表明，工程菌株的发酵产生的HrpN蛋白可以有效地防治大白菜软腐病。将Harpin蛋白农药中加入乳糖和酵母粉这两种诱导剂，在8～10t发酵罐中试验，培养18h,Harpin蛋白质产量最高可以达到4.78g/L，有效降低了Harpin的生产成本。Harpin蛋白农药田间使用的有效剂型为粉剂，适宜剂量为160μg/mL，喷施方法为叶面喷雾，大田应用研究表明，Harpin蛋白农药对大白菜等蔬菜的防虫、杀虫和促生长作用十分明显，其效果与化学农药相当[37,38]。武汉天惠生物工程有限公司完成登记并投产的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂抗灰霉、白粉2种病害，为细菌性植物保护剂，是多种植物病原菌的竞争性抑制剂。它通过竞争性生长繁殖占据生存空间的方式来阻止植物病原菌的生长，能在植物表面迅速形成一层保护膜，使农作物免受病原菌为害[39]。

　　4 细菌源蛋白质农药存在的问题与发展前景

　　4.1 细菌源蛋白质农药存在的问题

　　我国生物资源极为丰富，且细菌菌种种类较多，为防治植物病虫害提供了物质基础。大量的化学农药制剂的施用，使得水果和蔬菜及粮食的农药残留量超标10%～20%。发展细菌源蛋白质农药产业不但保障人们的健康和生态环境，而且有利于农业的可持续发展，增强我国农产品的国际竞争力[40]。由于细菌源蛋白质农药是一项尖端技术，开发成本高，它的价格比一般化学农药高，效果较慢，虽然我国筛选出的农抗品种很多，但大多只停留在实验室研究或小范围内使用的水平，研究开发滞后于生产应用[41]。在技术方面存在着尚未克服的问题，细菌源蛋白质农药制剂本身不够稳定，导致产品质量不稳定，防治效果受环境因素的影响，对细菌源蛋白质农药的安全问题没有统一的标准等[42]。

　　4.2 细菌源蛋白质农药的发展前景

　　目前细菌源蛋白质农药的研发已经在原有微生物制剂开发的基础上，向新功能、分子设计或重组生物农药方向发展，并取得了可喜的成果。细菌源蛋白质农药属于植物免疫调控剂，能最大限度地诱导植物自身抗逆性，具有对环境无污染、对人畜安全、产品无残留、提高产量等优点，已被广泛应用于植物病害防治中。细菌源蛋白质农药的应用是从根本上解决植保问题的重要途径[43]，同时也是农业可持续发展的重要内容，细菌源蛋白质农药具有十分广阔的应用前景，并能产生巨大的经济、社会和生态效益。

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