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基于Wnt/β-链蛋白信号通路探究黄连素对前列腺癌细胞增殖、凋亡

摘    要：目的：探究黄连素对前列腺癌细胞增殖、凋亡能力及Wnt/β-链蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路的影响。方法：选取生长良好的前列腺癌细胞株DU145，随机分为对照组与黄连素低、中、高剂量组，分别对各组细胞进行干预。对比细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭情况，检测细胞Wnt/β-catenin通路表达量。结果：黄连素低、中、高剂量组各时间点细胞增殖率低于对照组，凋亡率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；黄连素高剂量组细胞增殖率低于黄连素低、中剂量组，凋亡率高于黄连素低、中剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。黄连素低、中、高剂量组细胞侵袭细胞数、迁移细胞数低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；黄连素高剂量组细胞侵袭细胞数、迁移细胞数低于黄连素低、中剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。黄连素低、中、高剂量组细胞Bax、Caspase3、Caspase9表达高于对照组，Bcl-2表达低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；黄连素高剂量组细胞Bax、Caspase3、Caspase9表达高于黄连素低、中剂量组，Bcl-2表达低于黄连素低、中剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。黄连素低、中、高剂量组细胞Wnt、β-catenin、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达量低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；黄连素高剂量组细胞Wnt、β-catenin、VEGF蛋白表达量低于低、中剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：黄连素干预可促进前列癌细胞凋亡，其机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路相关。
关键词：前列腺癌;黄连素;细胞增殖;细胞凋亡;
 
前列腺癌是男性常见恶性肿瘤之一，其症状包括夜尿增多、尿频、尿急、尿痛等[1]。采用中药治疗癌症可以缓解患者的病情、症状与减轻痛苦，延长患者生命，降低癌症的死亡率[2]。我国中医学将前列腺癌归于“血淋”“癃闭”范畴，黄连素可阻断促癌物质对潜在癌变细胞的作用，从而起到防癌效果[3,4]。Wnt/β-链蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路是细胞内信号转导的主要途径之一，参与了多种恶性肿瘤的病理过程[5]。本研究对黄连素促进前列腺癌细胞增殖、凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的机制进行分析，为临床治疗提供借鉴依据，现报告如下。
材料与方法
研究细胞：前列腺癌细胞株DU145来源于中科院上海细胞生物研究所。本研究通过医院伦理委员会批准。
方法：(1)细胞培养：将前列腺癌细胞置于胎牛血清(37℃)培养基中，1 000 r/min，离心5 min，弃掉上层血清，将细胞置于培养箱培养(37℃、5%CO2)，培养融合度至90%时，胰蛋白酶消化处理传代。(2)细胞分组干预：培养后将前列腺癌细胞分为对照组与黄连素低、中、高剂量组，分别给予0µmol/L、25µmol/L、100µmol/L、200µmol/L的黄连素培养。
指标检测：(1)细胞增殖：使用CCK8测定细胞增殖，用酶标仪测定OD450值，以评价细胞增殖情况。(2)细胞迁移：使用划痕实验测定细胞迁移能力，显微镜查看细胞迁移状况。(3)细胞凋亡：使用TUNEL法检测细胞凋亡，荧光显微镜观察细胞凋亡情况，细胞凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%。(4)细胞侵袭：使用倒置显微镜观察细胞侵袭状况。(5)细胞Wnt/β-catenin通路蛋白：使用Western Blot法检测蛋白表达情况，所有步骤按照说明书进行。(6)分析细胞调亡相关蛋白效果。
统计学方法：数据应用SPSS 26.0统计学软件分析；计量资料以(±s)表示，采用t检验，多组对比行F检验；P<0.05表示差异有统计学意义。
结果
各组细胞增殖率、凋亡率比较：黄连素低、中、高剂量组各时间点细胞增殖率低于对照组，凋亡率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；黄连素高剂量组细胞增殖率低于黄连素低、中剂量组，凋亡率高于黄连素低、中剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 各组细胞增殖率、凋亡率比较(±s,%)
注：与对照组比较，*P<0.05；与黄连素低剂量组比较，#P<0.05；与黄连素中剂量组比较，△P<0.05
各组细胞侵袭、迁移能力比较：黄连素低、中、高剂量组细胞侵袭细胞数、迁移细胞数低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；黄连素高剂量组细胞侵袭细胞数、迁移细胞数低于黄连素低、中剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
表2 各组细胞侵袭、迁移能力比较(±s，个)
注：与对照组比较，*P<0.05；与黄连素低剂量组比较，#P<0.05；与黄连素中剂量组比较，△P<0.05
各组细胞凋亡相关蛋白效果分析：黄连素低、中、高剂量组细胞Bax、Caspase3、Caspase9表达水平高于对照组，Bcl-2表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量组细胞Bax、Caspase3、Caspase9表达水平高于黄连素低、中剂量组，Bcl-2表达低于黄连素低、中剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。
表3 各组细胞凋亡相关蛋白效果分析(±s)
注：与对照组比较，*P<0.05；与黄连素低剂量组比较，#P<0.05；与黄连素中剂量组比较，△P<0.05
各组细胞Wnt/β-catenin通路蛋白表达量比较：低、中、高剂量组细胞Wnt、β-catenin、()VEGF蛋白表达量低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量组细胞Wnt、β-catenin、VEGF蛋白表达量低于低、中剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，表4。
图1 各组细胞Wnt/β-catenin表达
表4 各组细胞Wnt/β-catenin通路蛋白表达量比较(±s)
注：与对照组比较，*P<0.05；与黄连素低剂量组比较，*#P<0.05；与黄连素中剂量组比较，*#△P<0.05
讨论
前列腺癌由于早期症状轻，容易被忽视，疾病发展至晚期或已转移的可能性加大，如早期诊断和治疗，预后尚可，晚期则预后不佳[6]。
调控前列腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力，是治疗前列腺癌的重要因素[4,7]。干预后，前列腺细胞增殖率下降、凋亡率上升，随着黄连素剂量增加，细胞增殖、凋亡变化显著，提示黄连素可抑制癌细胞的表达，可能是调控细胞凋亡相关蛋白表达，起到调控细胞增殖、凋亡的作用。Bcl-2、Bax是改变线粒体通透性的关键调控因子，Caspase3、Caspase9表达变化与细胞的生长、分化相关[5,6,7,8]。本研究结果显示，Bax、Caspase3、Caspase9表达上调，Bcl-2表达下调，随着黄连素剂量提升，相关蛋白表达变化更显著，说明黄连素可调控线粒体凋亡蛋白表达，进而促进前列腺干细胞凋亡。
Wnt/β-catenin信号通路是一种蛋白质网络，研究显示，该信号通路在多种肿瘤中可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡[9]。有研究发现，β-catenin信号通路活性与干细胞的演进相关，活性较高的癌细胞在其通路体现出更高的干细胞的特性，可为前列腺癌的治疗提供新靶点[10]。Wnt/β-catenin信号通路的激活可引起干细胞异常增殖、分化。随着黄连素剂量提升黄连素可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制前列腺癌细胞分化，且发挥抑制癌细胞增殖的作用与黄连素剂量相关。
综上所述，黄连素干预可促进前列腺癌细胞凋亡，其机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路相关。
 
参考文献
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