星形胶质细胞、胶质纤维酸性蛋白及内皮抑素水平与重症创伤性脑损

摘要：目的：探讨星形胶质细胞(AC)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及内皮抑素(ES)水平与重症创伤性脑损伤(TBI)结局的关系。方法：选取105只健康雄性Wistar大鼠，采用随机数字表法分为健康组、TBI组、假手术组，各35只。TBI组采用改进的Feney's自由落体撞击法制作脑外伤模型，保证撞击后大鼠的神经功能损伤评分相同；假手术组仅切开头皮和颅骨开窗；健康组不做处理。各组分别在伤后6 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d随机取出5只大鼠，应用改良神经功能损伤评分系统(mNSS)进行神经功能评分。常规苏木精-伊红染色法(HE)染色，采用免疫组织化学染色法作GFAP、ES染色，分别以AC、小胶质细胞的胞质内出现黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。结果：健康组及假手术组GFAP免疫组织化学染色AC胞质呈棕褐色，形如蜘蛛，周围有放射状突起；ES免疫组织化学染色无明显阳性细胞。TBI组HE染色，可见脑组织水肿，部分神经元及神经胶质细胞变性坏死，损伤3 d内，挫伤灶内细胞数目减少，随时间延长可见胶质细胞逐渐增生。TBI组GFAP阳性细胞平均面积随时间延长而逐渐增加，在7 d及14 d达到高峰，且TBI组阳性细胞平均面积大于健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。大鼠GFAP与重症TBI结局有关，其GFAP阳性细胞平均面积水平越高，mNSS评分越高。与健康组比较，TBI组6～24 h未检测到ES明显表达变化，差异无统计学意义(P>0.05)，伤后3～21 d ES含量逐渐增加，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：可通过AC、GFAP及ES水平判断重症TBI结局。

关键词：重症创伤性脑损伤;星形胶质细胞;胶质纤维酸性蛋白;内皮抑素;

创伤性脑损伤(TBI)是临床十分常见的急危重症，不仅可导致受损脑组织神经元变性坏死，也可引起邻近区域的神经胶质细胞、内皮细胞改变，并常有免疫细胞介入[1]。星形胶质细胞(AC)可以产生神经营养因子，维持神经元的生长、发育和生存，中枢神经系统损伤后，AC出现明显的功能活跃胶质化，并能分泌多种诱导因子促进神经纤维再生，挽救濒临死亡的神经元[2]。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是AC特有的细胞骨架蛋白，其过量表达是AC活化的重要特征[3]。内皮抑素(ES)是作用最强的血管再生抑制剂，极有可能具有抑制AC活化程度的作用，对受损脑组织修复有至关重要的影响。本次研究就AC、GFAP及ES与重症TBI结局的关系进行探讨，以期为临床治疗提供新的思路和方法。

材料与方法

选取105只健康雄性Wistar大鼠，体重24～25 g，采用随机数字表法分为健康组、TBI组、假手术组，各35只。实验过程中遵守实验动物管理与保护准则。

方法：TBI组采用改进的Feney's自由落体撞击法制作脑外伤模型，保证撞击后大鼠的神经功能损伤评分相同。假手术组仅切开头皮和颅骨开窗，3.3%水合氯醛按1 m L/100 g腹腔注射麻醉，俯卧位固定头部，无菌条件下用磨钻在人字缝前2 mm、中线旁2 mm处钻孔，直径约5 mm，保持硬脑膜完整。健康组不作处理。各组分别在伤后6 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d随机取出5只大鼠，应用改良神经功能损伤评分系统(m NSS)进行评分。断头处死大鼠，置超净工作台，开颅、完整取出鼠脑，于Bromega区后3.8 mm处，冠状切取2 mm厚脑组织，采用4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、组织切片，4℃冰箱保存。常规苏木精-伊红染色法(HE)染色，采用免疫组织化学染色法作GFAP、ES染色，分别以AC、小胶质细胞的胞质内出现黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞，采用Media Cyberretics Image Pro Plus6.0图像分析系统，测定阳性细胞的光密度值。大鼠断头处死前，1侧眼球取血，血标本置于37℃水浴箱孵育30 min，待血清自然析出后5 000 r/min离心10 min，留取血清-20℃保存备用，ELISA法检测ES水平，按试剂盒说明书操作。

统计学方法：数据应用SPSS 18.0统计学软件分析；计量资料以x±s表示，采用t检验；P<0.05为差异有统计学意义。

结果

脑组织病理改变：健康组及假手术组GFAP免疫组织化学染色AC胞质呈棕褐色，形如蜘蛛，周围有放射状突起；ES免疫组织化学染色无明显阳性细胞。TBI组HE染色，可见脑组织水肿，部分神经元及神经胶质细胞变性坏死，损伤3 d内，挫伤灶内细胞数目减少，随时间延长可见胶质细胞逐渐增生。

GFAP阳性细胞与重症TBI结局的关系：TBI组GFAP阳性细胞平均面积随时间延长而逐渐增加，在7 d及14 d达到高峰，且TBI组阳性细胞平均面积大于健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。大鼠GFAP与重症TBI结局有关，其GFAP阳性细胞平均面积越高，m NSS评分越高。

表1 不同时间点GFAP阳性细胞平均面积比较(%)

注：与健康组比较，*P<0.05

不同时间点ES水平比较：与健康组相比，TBI组6～24 h未检测到ES明显表达变化，差异无统计学意义(P>0.05)；伤后3～21 d ES含量逐渐增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 不同时间点ES水平比较

讨论

TBI外伤占全身各部位损伤的第2位，死亡率和伤残率居第1位。脑外伤不仅可导致受损脑组织神经元变性坏死，也可引起邻近区域的神经胶质细胞、内皮细胞改变。由于神经元修复机制非常复杂，目前对于TBI临床上大多采取传统对症治疗，很难从细胞和分子水平上控制中枢神经系统的损伤，所以深入研究影响神经元营养修复的相关因素，对临床工作具有重要的指导意义。

中枢神经系统损伤后，AC出现明显的功能活跃胶质化，原因是多方面的，如创伤后脑组织碎片增多，小胶质细胞迅速活化并释放细胞因子，来自AC自身、神经元、单核细胞及粒细胞释放的活性物质等[4,5]。Kawata等[6]研究发现大鼠脊髓损伤后期AC增生肥大，在液化区和正常脊髓组织之间形成障碍，增生的瘢痕组织阻止轴突的生长。所以TBI早期促进AC活化，对减轻外伤后神经元损伤以及促进修复具有重要作用。GFAP在维持AC形态和功能上都有作用，参与细胞内骨架重组、细胞黏附、维持脑内髓鞘形成和神经元的结构以及作为细胞信号转导通路等。广泛的生理生化损伤和严重的病理生理改变，刺激成熟AC合成GFAP，这种神经胶质活跃的过程是AC对脑内任何严重损害的一种特有反应[7,8]。ES是胶原蛋白ⅩⅧ的水解片段，在体内分布广泛，生理状态也有一定的表达，它主要有影响细胞迁移、凋亡及细胞周期的生物学功能。

本研究通过检测TBI后不同时间点大鼠损伤灶周围皮层及海马区脑组织中GFAP、ES的表达水平，观察相应时间点AC的形态变化，探索外伤后GFAP、ES变化规律与神经修复的相关性，结果显示，健康组及假手术组GFAP免疫组织化学染色AC胞质呈棕褐色，形如蜘蛛，周围有放射状突起；ES免疫组化染色无明显阳性细胞。TBI组HE染色，可见脑组织水肿，部分神经元及神经胶质细胞变性坏死，损伤3 d内，挫伤灶内细胞数目减少，随时间延长可见胶质细胞逐渐增生。TBI组GFAP阳性细胞平均面积随时间延长而逐渐增加，在7 d及14 d达到高峰。提示光镜下观察TBI大鼠模型损伤灶周围皮层及海马区脑组织，神经元、AC形态发生不同程度改变。而目前，临床大量关于脑损伤后GFAP动态变化过程的研究显示，GFAP阳性细胞开始增加的时间最早为伤后30 min，一般在伤后1～2周增加最为明显，伤后21 d开始下降[9,10]。各组报告的时间变化不全相同，但总体变化规律基本一致，本研究与以往研究结果较为一致。

本研究记录相应时间点TBI大鼠的神经功能损伤评分，研究GFAP、ES与脑外伤程度的关系，结果显示，在伤后6 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d，大鼠GFAP均于重症TBI结局有关，其GFAP阳性细胞平均面积水平越高，m NSS评分越高，提示TBI大鼠模型不同时期脑组织部位中GFAP的表达水平不相同，脑外伤后AC活化反应是可扩散的。而TBI组血清ES水平显著上升，提示不同时间点大鼠损伤灶周围皮层与海马区脑组织中GFAP、ES表达水平不全相同，相同部位的GFAP、ES动态变化具有相关性，与神经功能损伤评分也具有相关性。

综上所述，通过对AC、GFAP及ES水平的观察，可以在评估重症TBI所处的神经损伤状态，为临床促进神经恢复提供新的诊疗思路。

参考文献

[1]唐佳琦，卢韵碧小胶质细胞与创伤性脑损伤关系的研究进展[J]中国细胞生物学学报2021,43(8):1714-1721.

[2]苏晓梅,张丹参星形胶质细胞与神经退行性疾病的相关性[J]中国药理学与毒理学杂志,2019,33(10):118-119.

[3]赵晶晶,杨振坤,孙洁,等AMPK激动剂AICAR抑制糖氧剥夺损伤后星形胶质细胞的炎性反应及对神经元损伤的保护作用[J]蚌埠医学院学报2018,43(4):450-453.

[4]马羽霄,杨春，冯军峰小胶质细胞对创伤性脑损伤病理生理影响的研究进展[J]中华创伤杂志,2020,36(8):743-748.

[5]黄洁鸿,李惠璐，黄文瑶,等.自身兔疫性胶质纤维酸性蛋白星形细胞病的研究现状[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2019,26(6):437-440.

[6] Kawata K,Liu CY,Merkel SF,et al.Blood biomarkers for brain injury:What are we measuring?[J].Neuroscience Biobehavioral Reviews ,2016,68.460-473.

[7]林靖,张炜郑小强，等大鼠轻型颅脑损伤后星形胶质细胞与神经元的病理改变[J].中国临床神经外科杂志,2018,23(4):246-249.

[8]李敏淑，任洪磊朱晓冬等.神经胶质细胞在出血性脑损伤中的作用及可能的干预靶点[J]中国医师进修杂志，2018, 41(11):1042-1046.

[9]王小雯血清骨桥蛋白、神经胶质纤维酸性蛋白及生长分化因子15水平在急性脑梗死患者神经损伤及预后评估中的应用价值[J].新乡医学院学报,2019,36(5):479-482.

[10]王明达，周亮罗天元，等星形胶质细胞在髓鞘形成与修复中作用的研究进展[J]神经解剖学杂志,2019,35(4):451-454.