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异种移植中调节性免疫细胞的应用研究综述

摘    要：　异种移植是未来解决器官短缺最有前景的方法。近年来基因编辑和免疫学技术的进步推动了异种移植的快速发展,但是异种移植的临床应用仍然存在诸多难以克服的障碍，其中排斥反应是引起异种移植失败的最重要原因。调节性免疫细胞是机体内一群具有负性调节功能的免疫细胞，能够抑制同种异体移植排斥反应，延长移植物的存活时间。本文总结了近几年调节性免疫细胞在异种移植应用的研究进展，为异种移植排斥反应预防和治疗提供参考。
 
　　关键词：　调节性免疫细胞; 异种移植; 排斥反应; 移植免疫; 调节性T细胞(Treg); 调节性树突状细胞(DCreg); 滤泡调节性T细胞(Tfr); 调节性B细胞(Breg);
 
　　Abstract：　Xenotransplantation is the most promising method to resolve the organ shortage problem in the future. In recent years, the advances in gene editing and immunological technique have driven the rapid development of xenotransplantation. However, there are still many insurmountable obstacles in the clinical application of xenotransplantation, among which the rejection is the most important cause of the xenotransplantation failure. Regulatory immunological cells are a group of immunological cells with the negative regulation function in the body, which can inhibit allotransplantation rejection and prolong the survival time of the graft. This paper summarized the research progress of regulatory immunological cells in the xenotransplantation application in recent years, providing reference for the prevention and treatment of xenotransplantation rejection.
 
　　Keyword：　Regulatory immunological cell; Xenotransplantation; Rejection; Transplantation immunity; Regulatory T cell(Treg); Regulatory dendritic cell(DCreg); Follicular regulatory T cell(Tfr); Regulatory B cell(Breg);
 
　　异种移植是指不同种类动物器官（组织或细胞）进行移植或移植给人类，是未来解决器官短缺最有前景的方法。近年来基因编辑和免疫学技术的进步推动了异种移植的快速发展，越来越多的学者从事该领域研究。但是异种移植的临床应用仍然存在诸多难以克服的障碍，其中排斥反应是引起异种移植失败的最重要原因。相对于同种异体移植，异种排斥反应更剧烈更难克服，机制也更复杂。目前临床常用的治疗手段很难达到令人满意的效果，且可引起患者出现免疫力极度低下和病原体感染等严重并发症[1]。调节性免疫细胞是机体内一群具有负性调节功能的免疫细胞，大量临床和基础研究证实调节性免疫细胞能够抑制同种异体移植排斥反应，延长移植物的存活时间[2]。本文总结了近几年调节性免疫细胞在异种移植应用的研究进展，为异种移植排斥反应的预防和治疗提供参考。
 
　　1、 异种移植历史回顾
 
　　1964年Reemtsma等[3]首次报道了黑猩猩供肾给人类的异种移植。之后Starzl等[4]施行了狒狒作为供者的6例肾脏移植和2例肝脏移植。然而这些早期异种移植的受者或移植物存活时间均未超过1年，导致异种移植的临床与基础研究进入了低谷。上世纪80年代后，同种异体移植器官严重短缺引起了移植学家对异种移植的再次关注。1994年，Starzl等[5]报道2例狒狒供体的肝脏移植。1995年Makowa等[6]报道了1例猪供肝脏移植，以暂时性移植肝支持暴发性肝衰竭患者的肝功能。
 
　　基因编辑和免疫学技术的快速发展，使得近十多年异种移植取得了飞速的进展。Mcgregor等[7]将转人CD55基因猪的心脏移植给狒狒，同时应用高强度的免疫抑制方案，并输注可溶性Gal抗原以清除体内天然抗体，移植物中位存活时间达到76 d，但同时受体也出现了一系列由过度免疫抑制而引起的感染并发症。Mohiuddin等[8]利用CD40抗体，将敲除α-1,3-半乳糖（α-1,3-Gal）基因和过表达两种人体蛋白基因的猪心脏移植到狒狒体内，结果显示平均存活时间为298 d，最长的1只已经存活了945 d。虽然缺少临床研究数据，其他器官大动物异种移植均取得了较大进步，肾脏、肝脏和肺脏移植物的最长存活时间分别达到了310 d、29 d和7 d。猪胰岛可能是未来最早进入临床应用的异种移植器官（组织），目前已经有数种异种胰岛产品正在进行临床实验，显示异种胰岛可显着减少患者胰岛素的使用量。
 
　　2 、异种移植排斥反应
 
　　相对于同种异体器官移植，异种移植的排斥反应更为复杂更难克服，主要包括超急性排斥反应（hyperacute rejection,HAR）、急性血管性排斥反应（acute vascular rejection,AVR）、急性细胞性排斥反应（acute cell rejection,ACR）。早期研究证实种系关系较远动物之间的大器官移植均会立即受到HAR的破坏，以血管内血栓和血管间出血为主要特征。HAR常发生于非协调性异种移植后数分钟至数小时，机制是人体内预存的天然抗体与移植物血管内皮细胞表达的α-1,3-Gal抗原结合后，引发补体级联反应，从而严重破坏移植物。AVR以血管损害为主要特征，在AVR的早期即可见到移植物血管内皮表面有弥漫性的受者IgM或时有IgG的沉积。抗供者抗体、组织复合因子和凝血调节因子是AVR启动中重要的因素。若移植物能安全度过前两种排斥反应，人体还将对移植物产生主要由T细胞介导的排斥反应即ACR。CD4+T细胞、抗原提呈细胞和自然杀伤（natural killer,NK）细胞等在ACR致病过程中发挥着重要的作用[9]。
 
　　3、 调节性免疫细胞网络
 
　　除了效应性免疫细胞，人体内还存在很多发挥负性调节功能的免疫细胞，包括调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）、调节性树突状细胞（regulatory dendritic cell,DCreg）、滤泡调节性T细胞（follicular regulatory T cell,Tfr）和调节性B细胞（regulatory B cell,Breg）等。我们把这些具有负性调节功能的免疫细胞及其相互之间的复杂联系称为“调节性免疫细胞网络”，其在有效地启动免疫应答、调控应答的强度与平衡并适时终止的过程中，发挥精确的负性调节作用[10]。
 
　　近年来调节性免疫细胞在同种异体移植领域的基础研究和临床应用均取得了许多突破性进展。Treg是机体内最重要的调节性免疫细胞，在调控免疫应答和维持外周免疫耐受中发挥着关键作用。大量研究显示Treg可诱导同种异体肾脏、肝脏、心脏和肺脏免疫耐受，延长移植物的存活时间[11]。Breg和Tfr均与体液免疫紧密相关，研究发现这两种调节性免疫细胞能够早期诊断和预防同种异体移植后抗体介导的排斥反应（antibody mediated rejection,AMR）的发生[12]。调节性浆细胞（regulatory plasma cell,Preg）是最新发现的一种调节性免疫细胞，通过淋巴细胞活化基因-3分子（lymphocyte activation gene-3,LAG-3）和白细胞介素（interleukin,IL)-10发挥抑制浆细胞和抗体生成的功能[13]。因此Breg、Tfr和Preg在预防和治疗HAR和AVR中可能具有潜在的应用价值。
 
　　4、 Treg与异种移植
 
　　Treg是临床应用效果最明确的调节性免疫细胞，具有免疫抑制能力强、作用特异性高、可体外大量扩增等优点。Treg主要通过两种方式发挥生物学功能：一是直接作用，Treg高表达的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4,CTLA-4），能特异性结合B7分子，诱导活化的效应性T细胞处于免疫无能状态，此外Treg表面表达的人类白细胞抗原-G(human leucocyte antigen-G,HLA-G）、程序性细胞死亡受体-1(programmed cell death protein-1,PD-1）和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor,GITR）等能够通过直接细胞接触发挥免疫抑制功能；二是分泌方式，Treg可分泌IL-10、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和颗粒酶A等，抑制T细胞增殖活化和炎症因子释放，对体液免疫也具有一定的抑制作用[14]。近年来，许多研究显示Treg可进一步分为不同亚型，不同亚型Treg具有不同的特异性表面标志物和生物学功能。CD150highTreg和IL-35-producing Treg具有很强的免疫调控功能，而Foxp3lowCD45RA-Treg不具有免疫抑制作用，且能分泌干扰素（interferon,IFN）-γ等炎症因子[15,16]。
 
　　Treg在异种移植中的应用是目前的研究热点。许多研究证实人或者啮齿类动物的Treg在体外可有效抑制T细胞介导的抗猪异种排斥反应。Wu等[17]研究发现猪-啮齿类动物胰岛细胞移植后，耐受组淋巴细胞分类中Treg比例显着升高，清除Treg会显着提高异种排斥反应的发生率。Yi等[18]构建猪-狒狒异种心脏移植模型，发现Treg数量降低与排斥反应的发生紧密相关，而耐受受者体内Treg数量在移植早期即呈上升趋势。在猪-小鼠异种胰岛移植中，移植3 d后Treg治疗可显着延长移植物存活时间（>100 d），而对照组仅存活35 d。也有研究显示Treg治疗能够通过诱导B细胞凋亡，降低大鼠-小鼠异种心脏移植排斥反应的发生率[19]。然而在大动物异种移植实验中，Treg治疗效果并不理想。Shin等[20]进行了猪-恒河猴异种胰岛移植实验，移植后输注体外扩增的Treg到受者体内，结果显示停止免疫抑制剂使用后，异种胰岛依旧会发生强烈的排斥反应，也未观测到存活时间明显延长。这可能存在几个方面的原因：（1）相对于免疫抑制剂，Treg作用更为平缓和温和，很难抑制住剧烈快速的异种排斥反应；（2）异种排斥反应的微环境会严重损伤移植Treg的功能，部分Treg甚至会转换为Foxp3lowCD45RA-Treg等促排斥反应亚型；（3）目前异种移植研究主要集中在HAR和AVR这两种体液免疫相关急性排斥反应，而对T细胞介导的异种排斥反应机制了解很少。
 
　　5 、DCreg与异种移植
 
　　树突状细胞（dendritic cell,DC）分化成熟可分为4个阶段，因此按照成熟程度，DC可分为DC前体细胞、未成熟DC(immature DC,imDC）、迁徙期DC和成熟DC(mature DC,m DC），这是目前最常用的分类方法。mDC是最重要的抗原提呈细胞，在异种排斥反应中发挥着重要作用，可引起强烈的受者T细胞活化反应。imDC也可被称为耐受性DC，细胞表面高表达吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine2,3-dioxygenase,IDO）和免疫球蛋白样转录子4(immunoglobulin-like transcript 4,ILT4）等，可抑制T细胞增殖活化、介导T细胞凋亡和自噬、诱导Treg增殖等，因此具有诱导异种移植物免疫耐受的功能[21]。此外，许多研究报道了一种DCreg，具有很强的免疫抑制功能。大量研究证实DCreg可显着延长同种异体移植物的存活时间，并诱导其免疫耐受[22]。Ezzelarab等[23]构建非人灵长类动物肾移植模型，在移植前1 d输注供者抗原冲击的DCreg，结果显示其可以显着延长移植物的平均存活时间，且未检测到供体特异性抗体。DCreg进入临床实验早期主要治疗自身免疫性疾病，结果显示DCreg输注对类风湿性关节炎、1型糖尿病和克罗恩病均具有一定的治疗效果，且安全性也得到了很好的验证。对于同种异体移植，多项DCreg治疗的临床实验已经得到了批准，目前正在美国匹兹堡大学等机构实施[24]。
 
　　DCreg在异种移植的应用目前尚处于起步阶段。Tian等[25]在猪-小鼠胰岛异种移植前输注CTLA4-IgG4修饰imDC，结果显示其可以显着延长移植物的存活时间，增加脾脏中Treg数量。Madelon等[26]使用雷帕霉素（rapamycin,Rapa）或者IL-10诱导单核细胞向DC分化，发现Rapa-DC和IL-10-DC均可以抑制人抗猪NK细胞活化及IFN-γ的产生，IL-10-DC还对人抗猪细胞毒性T淋巴细胞激活具有很强的调控作用。Li等[27]在培养基中加入特定抗炎分子，可以快速诱导狒狒耐受型DC产生，这种DC高表达IL-10和TGF-β1，可抑制猪效应性T细胞增殖和IFN-γ的产生。DCreg在大动物异种移植的治疗效果目前尚不清楚，需要进一步实验验证。此外，imDC应用于异种移植存在一定的争议，在排斥反应或者缺血-再灌注微环境下，imDC可能会进一步分化为mDC，加重排斥反应或者至少没有显着免疫抑制功能，采用环孢素、他克莫司或者维生素D3等诱导imDC产生致耐受原特性可能具有一定的治疗效果。
 
　　6 、结语
 
　　异种移植是人类多年来不懈探索的领域，临床异种移植尚无成功的经验。近年来异种移植基础研究进展迅速，大动物异种移植物存活时间显着延长，猪内源性逆转录病毒感染问题也得到了解决。排斥反应依旧是导致异种移植失败的最主要原因，调节性免疫细胞治疗为这一问题解决带来了曙光。Treg和DCreg均能显着延长异种移植物存活时间，诱导免疫耐受。目前调节性免疫细胞治疗也存在很多问题，在大动物异种移植中的治疗效果也不甚理想。相信随着基因编辑、免疫学和外泌体技术的进一步发展，调节性免疫细胞在异种移植中的治疗效果将会满足临床需求。最后我们引用器官移植巨匠Sir Roy Calne的一句话：Clinical xenotransplantation is just around the corner,but it may be very long corner。
 
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