元胡生物碱成分在元胡止痛片质量控制中的研究

摘要：目的：分析元胡生物碱成分在元胡止痛片质量控制中的作用。方法：通过整理元胡相关文献，了解元胡的化学成分和药理作用，制定出元胡止痛片质量控制方案。使用多种色谱方法对元胡药材中化学成分进行分离并研究，再针对所得成分采用核磁共振、质谱以及物理化学性质进行结构鉴定，通过一测多评法测定元胡止痛片中的生物碱类成分和含量。结果：元胡药材共成功分离5种单体化合物，分别为去氢紫堇碱、d-紫堇碱、海罂粟碱、四氢巴马汀、四氢小檗碱。通过一测多评法测定4批元胡止痛片中上述生物碱成分，显示不同厂家生产的元胡止痛片中总生物碱含量差异明显。结论：通过多种色谱方法测定可以较为准确地出元胡药材中的有效生物碱成分，针对元胡止痛片采用一测多评法可以有效检测出不同生物碱成分和剂量，可作为元胡止痛片的质量控制方法，为进一步完善元胡止痛片质量标准提供科学的参考依据。

关键词：元胡生物碱;元胡止痛片;质量控制;

元胡止痛片主要是由元胡(延胡索)、白芷2味药材组成的中成药，具有活血祛瘀、顺气止痛等效用[1]。其中元胡作为主药，所含的生物碱类物质为主要的镇痛成分，近年来国内外针对其含量测定的探讨较多，但质量控制和质量标准仍无统一标准，常规测定方法耗时较长，且结果精确度不理想[2]。为进一步精准分析元胡生物碱成分在元胡止痛片质量控制中的作用，有效控制元胡止痛片生产用料比例，本研究采用多种色谱方法测定元胡药材化学成分，使用一测多评法测定4批元胡止痛片中相关生物碱成分和含量，现报告如下。

材料与方法

元胡药材自亳州市佰林堂药业有限公司网购共3 kg干燥块茎，4批元胡止痛片分别购自葵花药业集团隆中有限公司(Z42020501)、广西维威制药有限公司(Z45021861)、甘肃众友药业制药有限公司(Z20043880)、广西药用植物园制药厂(Z45021589)。FA2004型电子天平(生产厂家：沈阳科瑞永兴化玻仪器有限公司)，TY10SP-752紫外可见分光光度计5 nm ZX21、TBE-100A高速逆流色谱仪(生产厂家：上海同田生物技术有限公司)，伍丰高效液相色谱系统LC-100、pico Spin 80微型核磁共振波谱仪(生产厂家：上海超体生物科技有限公司)。高速逆流色谱仪分析使用甲醇、乙腈均为色谱纯(生产厂家：天津益仁达化工有限公司)，试验中用水主要为过滤蒸馏水，除甲醇、乙醇外，其他试剂均为分析纯。

方法：(1)元胡生物碱提取分离：首先取元胡药材2.5 kg进行粉碎，经35目筛网筛选过滤后形成药材粉末。将85%乙醇渗入药材粉末，减压回收乙醇，得到深棕色浸提物，加入酸碱度(p H)为2～3稀盐酸调节过滤后得到滤液。在滤液中加入氨水调节p H为9～10，静置12 h后再次过滤，得到黄色总生物碱沉(元胡总生物碱)。将元胡总生物碱通过硅胶柱色谱分离，最终形成不同部位，依次用不同比例的氯仿-甲醇进行梯度洗脱，分离得到6种不同化合物，编号为A～E。(2)元胡生物碱结构鉴定：采用醇-酸水-有机溶液提取法提取元胡生物碱，将4份止痛片细粉用工业甲醇浸泡3次，24 h/次，浓缩后用2%HCl溶解，随后采用乙酸乙酯进行萃取，得出水层生物碱后用10%Na OH将p H值调至10，再次用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯层生物碱与水层后，将水层用正丁醇萃取，得元胡止痛片化合物。(3)元胡止痛片生物碱成分和含量测定：将元胡止痛片按不同厂家分为4份，将止痛片制成细粉后，使用75℃的石油醚脱脂1 h，待溶液挥干后，提取残渣，再次加入30 m L盐酸溶液(1.5%)，经超声处理30 min左右后过滤，提取剩余滤液。加入氯仿进行萃取，萃取后将其静置等待分层。分层完成后按高效液相色谱系统标准测定其吸收度，由回归方程计算出元胡止痛片中总生物碱的成分及含量。(4)精密度试验：对4个厂家供试品进行提取，提取方法：称取适量4份不同厂家0.3 g止痛片细粉，加入40 m L 0.1mol/L HCl溶液溶解，水浴法加热20 min，摇匀制冷，过滤后静置分层，随后分取氯仿液，用紫外分光光度计测得吸光度值为0.543、0.542、0.542、0.544,RSD为0.13%(n=4)表明该方法精密度良好。(5)重复性试验：取供试品4份(每份约1 g)分别进行测定，其结果平均含量15.34 mg/片，RSD为0.11%(n=4)。(6)稳定性试验：将4份供试品溶液在室温情况下分别放置0 h、0.5 h、1.0 h及2.0 h进行吸光度测定，同时监测放置时间对吸光度的影响。测定结果分别为0.239、0.240、0.240、0.238,RSD为0.41%(n=4)。提示该方法在2 h内吸光度基本无变化，具有较高的稳定性。

结果

元胡生物碱结构鉴定结果：(1)化合物A：无色针晶(甲醇)，碘化铋钾显色反应为阳性。CI-MS m/z 327[M+H]+;1HNMR(CDCl3,500 MHz)δ：6.89(1 H,d,J=7.6 Hz,H-,10),6.75(1 H,s,H-1),6.58(1 H,s,H-4);1CNMR(CDCI3,150 MHz)δ：150.2(C-1a),112.7(C-1),147.1(C-3),134.2(C-2),102.4(C4),28.2(C-5),132.4(C-12),48.4(C-6),151.9(C-9),135.7(C-10),121.6(C-11)。以上数据与相关文献一致，鉴定化合物A为四氢巴马汀[3]。(2)化合物B：浅黄色针晶，碘化铋钾反应呈阳性。CI-MSm/z 327[M+H]+;1HNMR(CDCI3,500 MHz2)δ：6.72(1 H,H-12),6.67(1 H,H-11),6.48(1 H,s,H-4),4.17(1 H,d,J=8.34 Hz,H-8);1CNMR(CDCI3,200MHz)δ：129.6(C-1a),110.3(C-1),134.4(C-2),147.4(C-3),131.4(C-4a),110.1(C-4),28.9(C-5),48.3(C-6),51.6(C-8),142.8(C-10),150.8(C-9),108.7(C-11),132.4(C-12)。以上数据与相关文献一致，鉴定化合B为四氢小檗碱[4]。(3)化合物C：黄色粉末(甲醇)，碘化铋钾反应呈阳性。CI-MSm/z 336[M+H]+;1HNMR(CDCl3,500 MHz)δ：8.21(1 H,s,H-11),6.48(1 H,s,H-3),3.82(3 H,s，﹣OCH3),3.54(3H,s,-OCH3),3.11(4 H,m,He-4),2.58(3 H,m,Ha-4),2.44(3 H,s,-NCH3);1CNMR(CDCl3,200 MHz)δ：148.9(C-2),110.4(C-3),30.5(C-4),50.4(C-5),62.5(C-6a),150.2(C-9),145.4(C-10),138.5(C-1),110.8(C-8),42.4(C-7)。以上数据与相关文献数据一致，鉴定化合物C为海罂粟碱[5]。(4)化合物D：无色棱柱结晶(甲醇)，碘化铋钾反应呈阳性。CI-MSm/z 360[M+H]+;1HNMR (CDCl3,400MHz)δ：6.82(1 H,d,J=7.6 Hz,,H-12),6.57(1 H,s,H-1),6.53(1 H,s,H-4),6.71(1H,d,J=7.5 Hz,H-11),4.30(1 H,d,J=14.5 Hz,H-14),3.70(1 H,d,J=14.6Hz Ha-8),3.22(1 H,m,H-13),2.53(2 H,m,H-5),3.21(2 H,m,H-6)。以上数据与相关文献数据一致，鉴定化合物D为d-紫堇碱[6]。(5)化合物E：黄色粉末，碘化铋钾反应呈阳性。CI-MSm/z 360[M+H]+;1HNMR(CDCl3,600 MHz)δ：8.12(1 H,s,H-1),7.36(1 H,s,H-11),7.28(1 H,s,H-4),5.31(2 H,t,H-6),4.06(2 H,t,H-5);1CNMR (CDCl3,200 MHz)δ：147.6(C-9),147.3(C-3),151.8(C-2),121.4(C-4a),115.7(C-4),27.3(C-5),141.4(C-8),150.6(C-10),125.7(C-11),115.8(C-12),120.3(C-1),57.3(C-6)。以上数据与相关文献数据一致，鉴定化合物E为去氢紫堇碱[7]。

不同厂家样品测定结果：元胡止痛片样品测定结果显示，不同厂家生产的元胡止痛片中总生物碱含量差异明显。见表1。

表1 不同厂家样品测定结果(mg/g)

讨论

现代药典中虽然对元胡止痛片中元胡乙素的含量进行了测定，但质量控制指标和研究方法较为单一，质量标准仍没有统一的规定。目前相关药物在使用过程中存在产品质量参差不齐的问题，为了保证元胡止痛片的用药安全，构建反映元胡有效化学成分和功效的质量控制方法至关重要。

高速逆流色谱等多种色谱方法可以有效鉴别元胡药材中的有效生物碱成分及活性特征，一测多评法可以通过1个对照品对多个指标成分同时定量，相较于传统含量测定方法具有简便、精准的优势，将两种方法有机结合能够节约医疗资源，降低质量监控成本，可以更全面地检测出药物中所含的有效生物碱成分和剂量。冯向冬等[8]在研究中指出使用高效液相色谱法可以有效测定出元胡止痛片中所含的活性成分和含量，可作为元胡止痛片的质量控制方法之一。刘瑞洁等[9]发现，在研究对照品缺乏的情况下，使用一测多评法可以准确、方便测定元胡止痛系列制剂中的有效成分和剂量。本次研究针对元胡生物碱成分在元胡止痛片质量控制中的应用做进一步分析，结果显示利用高速逆流色谱法等多种色谱方法从元胡药材中共成功分离5种单体化合物，分别为去氢紫堇碱、d-紫堇碱、海罂粟碱、四氢巴马汀、四氢小檗碱。通过一测多评法测定4批元胡止痛片中上述生物碱成分，最终结果显示不同厂家生产的元胡止痛片中总生物碱含量差异明显。其中，葵花药业集团隆中有限公司元胡止痛片样品生物碱含量较高，去氢紫堇碱为4个厂家最高，生物碱含量较低厂家为广西药用植物园制药厂，其四氢小檗碱、去氢紫堇碱分别为0.24 mg/g、2.45 mg/g；而广西维威制药有限公司海罂粟碱、d-紫堇碱也分别为单个生物碱含量中最低的厂家，分别为1.16 mg/g与0.25 mg/g。分析原因，元胡总生物碱化合物在氯仿中溶解度较大，一次性提取效果良好，且操作简单，精准度较高，可以作为元胡止痛片的质量控制手段。元胡总生物碱是元胡止痛片的主要镇痛成分，总生物碱的含量高低可以反映出元胡止痛片制剂的质量优劣和临床疗效，研究显示，不同厂家生产的元胡止痛片中总生物碱含量差异明显，提示增加元胡止痛片中总生物碱含量测定方法可以有效控制元胡止痛片的生产用料比例，保证药品生产质量[10]。

综上所述，通过多种色谱方法可以较为准确地测定出元胡药材中的有效生物碱成分，针对元胡止痛片采用一测多评法可以有效检测出不同生物碱成分和剂量，可作为元胡止痛片的质量控制方法，为进一步完善元胡止痛片质量标准提供科学的参考依据。

参考文献

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[10]邓磊和明伟,侯连兵HPLC-CAD法同时测定元胡止痛胶囊中6种生物碱及香豆素类成分的含量[J]中南药学,2019,17(1):88-92.