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无乳链球菌临床株对替加环素敏感性的影响

摘    要：目的：探讨无乳链球菌(GBS)临床株对替加环素敏感性的影响。方法：收集2014—2017年华中科技大学协和深圳医院GBS临床分离株136株，检测菌株的生物被膜形成能力、四环素(tet)耐药基因和多位点序列分型，分析其与替加环素敏感性的关系。结果：GBS对替加环素的敏感性为69.1%，其生物被膜形成能力与替加环素敏感性无显著相关性(P>0.05)。该研究临床分离的GBS携带四环素tetM基因，ST19型、ST17型菌株数量高(25株)，ST17型对替加环素具有较高的敏感性。结论：该地区GBS对替加环素较为敏感，ST17型菌株对替加环素具有较高的敏感性，可将其作为临床感染的治疗思路之一。
关键词：替加环素;无乳链球菌;敏感性;
 
无乳链球菌(GBS)属于B族链球菌，近年研究发现，GBS是侵袭性新生儿感染和免疫功能低下成人感染的重要病原体[1]。四环素对GBS具有高度耐药性，目前半合成四环素类药物替加环素成为大多数临床耐药菌株的选择[2]。本研究分析GBS菌株与替加环素敏感性之间的关系，以期为替加环素的临床应用提供数据参考，报告如下。
资料与方法
收集2014—2017年华中科技大学协和深圳医院患者羊水、尿液、血液等标本，分离GBS临床菌株共136株。
细菌鉴定与药敏试验：采用VITEK 2Compact系统鉴定GBS分离株，替加环素购自上海皓元生物医药科技有限公司，替加环素药敏试验以肺炎链球菌ATCC49619作为质控菌株，使用琼脂稀释法进行检测。替加环素对GBS的抗菌药物敏感折点为最低抑菌浓度(MIC)≤0.25 mg/L。
生物被膜检测与判读：以粪肠球菌OGRF菌株和CHS787菌株作为质控菌株，根据参考文献[3]方法检测GBS生物被膜的形成。细菌复苏后按1∶20稀释，以每孔200μL加入96孔板生长20 h，用磷酸盐缓冲液冲洗3次并用甲醇固定15 min，使用0.5%结晶紫染色10 min，蒸馏水冲洗并加入4∶1的无水乙醇和丙酮混合液，混合均匀后通过吸光度读数(OD 595)检测。每次测定重复3次，并取其均值作为最终读数。根据参考文献[3]方法判读生物被膜OD 595值并进行分类，GBS生物被膜形成能力分为弱(OD 595≤0.5)、中(0.5<OD 595<1.0)、强(OD 595≥1.0)。
多位点序列分型(MLST)与四环素(tet)抗性基因的测定：根据参照文献[4]设计GBS菌株管家基因，其引物和tet抗性基因(tetM、tetO、tetK)引物由华大基因公司合成，GBS基因组脱氧核糖核酸(DNA)按DNA提取试剂盒说明书快速提取，并通过聚合酶链式反应技术扩增上述基因。依据GBS的MLST数据库(http://pubmlst.org/organisms/streptococcus-agalctiae)，由华大基因公司将扩增后的产物进行标准序列对比，将所得到的管家基因序列应用软件DNAMAN.full.version.V 5.2.2进行分析，确定具体序列分型(ST)，使用琼脂糖凝胶电泳分析扩增条带情况，进行tet相关抗性基因的测定。
观察指标：(1)分析GBS生物被膜形成能力和替加环素药敏之间的关系；(2)分析GBS tet基因与替加环素药敏之间的关系；(3)分析GBS MLST分型与替加环素药敏的关系。
统计学方法：数据应用SPSS 26.0统计学软件分析；计数资料以n(%)表示，采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关系数检验；P<0.05为差异有统计学意义。
结果
GBS生物被膜形成能力和替加环素药敏之间的关系：136株GBS分离株的OD 595值为0.12～3.40，质控菌株粪肠球菌OGRF菌株和CHS787菌株所测得的OD 595值分别为0.91和1.60。本研究GBS菌株敏感率为69.1%，其中强生物被膜形成能力组替加环素敏感率(65.2%)较低，弱生物被膜形成能力菌株与强生物被膜形成能力菌株的替加环素MIC值与其生物被膜形成能力无相关性(r=0.107,P=0.392)。见表1。
表1 GBS生物被膜形成能力和替加环素药敏之间的关系
GBS tet基因与替加环素药敏之间的关系：本研究各耐药基因检出率，tetM+菌株60株(44.1%),tetK+菌株31株(22.8%),tetO+菌株46株(33.8%)，未检测到tetM+tetK+菌株。分析GBS对携带不同四环素耐药tet基因的敏感性，其中tetK+tetO+菌株及tetK+菌株对替加环素的敏感性(100%、80.6%)明显高于其他菌株，tetO+菌株对GBS的敏感性最低(65.2%),tetM基因检出菌株与替加环素MIC值无相关性(r=0.012,P=0.960)。见表2。
表2 GBS tet基因与替加环素药敏之间的关系
GBS MLST分型与替加环素药敏的关系：本研究GBS菌株共检测出18种不同分型，其中前3类流行菌株为ST19、ST17、ST10分型，ST22、ST27、ST1146、新分型各检出1例，归为其他类型。其中流行菌株中ST19型、ST17型菌株数量高(25株)，ST17型对替加环素敏感性较高(68.0%),ST28、ST103、ST651、ST739、ST885型GBS对替加环素完全敏感(100%),ST862、ST1、ST324分型对替加环素菌株的敏感性≤50%。见表3。
表3 GBS MLST分型与替加环素药敏的关系
讨论
GBS是临床中菌血症、软组织感染和尿路感染的常见病原体，不同地区GBS菌株对替加环素的敏感性存在一定差异。研究显示，我国福建[5]、黑龙江[6]地区分离的GBS菌株对替加环素完全敏感，具体药物MIC值未指出。本研究GBS对替加环素的敏感率为69.1%，其中GBS对替加环素的MIC50和MIC90分别为0.25、0.5 mg/L。
研究发现，细菌生物被膜可以保护细菌免受外界干扰，对抗菌药物的耐受性提高10～1 000倍[8]。本研究结果表明，GBS生物被膜形成能力与替加环素敏感性无显著相关性，考虑可能与本次研究GBS临床菌株数较少，且研究中所选取的检测方法、培养基类型和折点选择等因素与既往文献具有差异性，因此该结论有待进一步研究证实。有研究表明，替加环素主要是通过停止诱导四环素特异性tetK外排蛋白输出，从而起到克服其外排泵四环素耐药机制的作用[8]。本研究结果进一步证实了此结论。
本研究显示，替加环素对不同MLST分型菌株敏感性差异较大，以往研究发现我国南方地区以ST17、ST19分型GBS为流行菌株，且前者被认为具有高侵袭性的特点[9]。本研究在一定程度上验证了该结论，同时结果表明替加环素对于ST17型GBS菌株较为敏感。
综上所述，GBS对替加环素较为敏感，且对于携带tetK耐药基因的GBS敏感性较高，这可能与其克服tetK介导的外排泵抗性机制相关。本地区主要流行菌株中ST17型GBS对替加环素具有较高的敏感性，可将其作为临床感染的治疗思路之一。
 
参考文献
[1] Koide S,Nagano Y,Takizawa S,et al. Genomic traits associated with virulence and antimicrobial resistance of invasive group B streptococcus isolates with reduced penicillin susceptibility from elderly adults[J]. Microbiology Spectrum, 2022, 10(3):e0056822.
[2]Leng B, Yan G, Wang C, et al. Dose optimisation based on pharmacokinetic/pharmacodynamic target of Tigecycline[J]. J Glob Antimicrob Resist,2021,25:315-322.
[3] Desai D, Goh KGK, Sullivan MJ, et al. Hemolytic activity and biofilm-formation among clinical isolates of group B streptococcus causing acute urinary tract infection and asymptomatic bacteriuria[J].Int J Med Microbiol,2021,311(6):151520.
[4] Shabayek S,Abdalla S. Macrolide and tetracycline-resistance determinants of colonizing group B streptococcus in women in Egypt[J].J Med Microbiol,2014, 63(Pt10):1324-1327.
[5]谢海花3108例福州地区围产期孕妇无乳链球菌的检出率和耐药性分析[J].医学理论与实践,2019,32(23):3884-3886.
[6]姜洪文,刘青华,齐文晶等454株无乳链球菌感染的临床分布及耐药性分析[J].国外医药(抗生素分册),2020,41(3):240-242.
[7]陈小楠，申元娜，李彭宇等细菌生物膜的特征及抗细菌生物膜策略[J]药学学报,2018,53(12):2040-2049.
[8] Linkevicius M,Sandegren L.Andersson Dl.Potential of tetracycline resistance proteins to evolve tigecycline resistance[J].Antimicrob Agents Chemother,2016,60(2):789-796.
[9]程招敏柯培锋蓝锴等广州地区ST17无乳链球菌的分子流行病学特征及快速鉴定[J]中华医院感染学杂志,2020,30(8):1210-1216.

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